凋亡诱导因子（AIF）是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅因子的线粒体黄素蛋白，定位于线粒体膜间隙。除其在生物能量代谢与氧化还原代谢中的作用外，AIF通常被认为在经历蛋白水解后从线粒体转位至细胞核，从而在不依赖半胱天冬酶的凋亡通路中诱导染色质凝聚和DNA降解。

AIF中保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）结合结构域以及两个FAD结合基序，使其能够在FAD与NADH之间实现高效电子转移（ET）。此外，AIF还被发现具有NADH依赖的氧化还原酶活性，但其对底物的电子转移效率低于其他黄素蛋白。在线粒体膜间隙、细胞质及细胞核中，AIF能够与其他蛋白相互作用，从而调控呼吸链组装、核转位及DNA断裂等过程。

另一方面，细胞色素c（Cyt c）是一种含血红素的氧化还原蛋白，在细胞呼吸中发挥关键作用，同时也是内源性凋亡通路中的重要调控因子。在该过程中，它从线粒体释放到细胞质中，激活半胱天冬酶依赖的上游促凋亡信号。

在线粒体中，Cyt c与内膜上的心磷脂（CL）相互作用，可通过增强线粒体外膜通透化（MOMP）来调控其释放。AIF的氧化还原酶活性使其能够催化NADH依赖的Cyt c还原反应，并且研究发现AIF通常在Cyt c释放之后才被释放。

图1.示意图展示了线粒体内由NADH-AIF介导的促凋亡过程（摘自PNAS）

AIF被认为在从线粒体释放并进入细胞核后触发不依赖caspase的细胞死亡，但其在线粒体内部的促凋亡功能此前从未被研究。AIF与Cyt c均位于线粒体膜间隙，在NADH存在条件下，AIF可以还原Cyt c，而作者此前的研究表明，Cyt c的还原态相比氧化态对线粒体通透化具有更显著的促进作用。

然而，在二者释放之前，它们在膜间隙中的相互作用是否会协同促进凋亡仍不清楚。由于NADH依赖的AIF电子转移效率较低，可能诱导活性氧（ROS）生成，但这一过程是否与Cyt c介导的线粒体膜通透化相关尚未明确。

研究蛋白–配体相互作用及其结构–功能关系对于理解生物过程以及开发新疗法至关重要。核磁共振（NMR）、质谱以及冷冻电镜等先进结构表征技术已被用于研究生物大分子的结构与功能，但这些方法均无法在生理条件下对大分子及其动态过程进行原位探测。

相比之下，拉曼光谱可以实现这一目标。由于分子共振或表面等离子体共振效应，共振拉曼光谱与表面增强拉曼光谱（SERS）能够在复杂生物样品（如血清、细胞器及细胞）中实现对目标分子的高灵敏与高选择性指纹识别。拉曼光谱还可在水相环境中提供蛋白质及磷脂的精细结构信息，从而为理解程序性细胞死亡的分子机制提供新的手段。

本研究中，作者利用包括普通拉曼光谱、共振拉曼光谱、SERS及拉曼成像在内的无标记振动探针，探讨线粒体AIF的促凋亡功能。通过FAD与血红素c（heme c）的共振拉曼指纹信号，研究AIF与Cyt c之间的电子转移过程。证实了NADH依赖的AIF介导活性氧（ROS）生成，并进一步验证ROS诱导的不饱和脂质过氧化效应。

此外，通过具有内源拉曼信号的Cyt c与磷脂，对NADH–AIF–Cyt c介导的膜通透化过程进行了动态成像监测，并在原位条件下追踪Cyt c从线粒体释放的过程。借助分子动力学模拟（MD）与电子顺磁共振（EPR）进一步验证AIF与Cyt c的相互作用细节以及ROS与磷脂之间的反应机制。最终，在进一步NADH诱导凋亡验证的基础上，提出了AIF在尚未从线粒体释放之前即可触发凋亡的分子机制模型。

参考消息：https://doi.org/10.1073/pnas.2528689123